ByRichardHenderson
张凯
翻译
冷冻电镜技术利用了电子显微镜这个工具（仪器）。很显然，在年电子被J.J.汤姆森（Thompson）发现以前，这个概念是不可能被提出的。一旦人们从波粒二象性原理出发，弄清楚电子也可以像光波一样被聚焦后，恩斯特·鲁斯卡（ErnstRuska）便提出了电子显微镜这个概念。利用电子来成像有极其显著的优势，因为它的波长只有大约光波的10万分之一左右；大体上光波为1微米级别（注：可见光约～nm），而电子约为1皮米（10^-12米）。
原则上，你可以获得远远高于光镜的分辨率。但是，从技术上而言具有诸多挑战。直到大约上个世纪五六十年代，电子显微镜才可以解析一些原子结构。生物学家总是落后于其它学科（利用电子显微技术），那时的电镜用户主要集中在金属或类似的材料研究。原因是这样的：当你把有机分子组成的生物样品置于电子束之下进行成像之时，它会产生辐射损伤而毁掉生物样品的结构信息。在早期的大量尝试最终都以失败而告终。所有的成功应用都是对生物结构进行重金属染色之后再成像，这借鉴了材料科学家们的研究方法。
直到美国科学家BobGlaeser出现才改变了这个局面，他目前仍在伯克利。他曾指出辐射损伤意味着穿过样品的电子将破坏其化学键，改变原有结构信息（比如蛋白、脂等等），将它们“烧掉”。所以，氢键会被破坏，变成了气体，留下的只有一些结构残骸。Glaeser教授指出，由于辐射损伤的存在，你永远无法测定单个分子的结构。所以他提出使用晶体，通过这种方式，你可以弄清楚电子是如何和这些结构相互作用。这种情况下，你就拥有数十万个规则排列的分子。即使其中的一部分子结构被破坏，你也可以从中得到目标分子的结构信息。
Glaeser是最早和他的学生尝试利用冷却样品来克服或降低辐射损伤的科学家。他们把样品冷却到了大于-°C。这是他们当时所能够达到的极限，因为当时电子显微镜的真空极差，样品会被严重污染。直到上个世纪80年代，随着更好的真空系统、更好的冷台（用于冷却样品并使其保持低温）的出现，样品被冷却至液氮温度才变成可能。这主要归功于坐落于海德堡的欧洲分子生物学实验室（EuropeanMolecularBiologyLaboratory，EMBL）的JacquesDubochet教授及其研究组。
他系统研究了水在冷冻条件下的各种性状，研究了大概3-5年才有了结论。他指出：“当你冷冻水的时候，它常常形成冰晶；有时候，这是六边形的晶体；有时，是立方的晶体；但是，如果你非常迅速地冷冻液态水，它可以形成无定形的冰”。他发明了一种方法，利用吸附的方式形成薄的水膜，然后快速插入到冷却液体。起初，他们尝试了液氮，但是液氮温度通常都处于沸点附近，冷却表面形成大量气体，冷却速度极慢，这会导致冷却之后常常得到冰晶。后来他发明了我们目前广泛使用的生物样品冷冻方法。这个方法中，直接用于冷冻样品的是液态乙烷或丙烷，它们处于液氮环境，并被冷却至和液氮相当的温度（注：乙烷熔点约-°C，液氮沸点约?°C）。
我认为，Dubochet教授的工作标志着冷冻电镜技术真正的开始。那时候我们正在从事细菌视紫红质的二维晶体研究（注：Henderson与其合作者NigelUnwin年首次观测到细菌视紫红质七次跨膜螺旋结构）。我们刚开始是在室温环境进行研究，并没有对晶体进行冷却。当我们尝试把晶体冷却至液氮温度之时，我们获得了大约4-5倍于室温环境的可用数据。所以，事实上冷却并没有彻底克服辐射损伤，只是把损伤的程度降低了大约4-5倍。然后，我们利用冷冻电镜技术成功解析了这个二维晶体的结构(Hendersonetal.,)。
但是，冷冻电镜真正的强大之处在于它可以“冷冻一切”！你可以冷冻生物组织小碎片，你可以冷冻溶液中的分子，你可以冷冻重悬后的病*，你可以冷冻核糖体。事实上，你可以做任何你想做的事情。所以目前冷冻电镜可研究的范围至少覆盖了四五种不同的生物样品种类。每一种自身都非常有意义，并且可以从不同的侧面帮助你洞悉生物对象，提供重要结构信息。
最简单的一种方法就是冷冻我们现在称为“单颗粒”的悬浮分散对象。以核糖体为例，细胞中各种各样的蛋白质都在这里被合成。你可以把核糖体冷冻在一个很薄的水膜中，这样你就可以看到各个不同方向的核糖体的二维投影图。你可以从照片中挑选出一个一个核糖体的“单颗粒”；如果数量足够，比如目前大约需要1-2万个，你就可以将这些各个不同方向的核糖体平均，进而得到三维结构。
基本原理和CT（